一、分离原理与优势
亲水作用机制
HILIC通过固定相极性基团（如酰胺基、二醇基）与蛋白质表面极性基团（羟基、氨基）的氢键作用实现分离，尤其适合糖基化蛋白等强极性生物大分子
与反相色谱（RPLC）形成正交互补，可解决RPLC中极性蛋白保留不足的问题
流动相以高比例有机溶剂（乙腈/水）为主，兼容质谱检测（电离效率提升30%）
技术突破
Waters ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide 300A等大孔径柱（1.7μm）的推出，使完整蛋白质分离成为可能
二、典型应用场景
糖蛋白分析
专用于N-糖链、O-糖链及糖基化位点鉴定，可区分单/双/三唾液酸修饰
Atlantis Premier BEH Z-HILIC柱通过杂化颗粒技术，提升糖肽保留率50%
蛋白质组学研究
与RPLC联用构建二维色谱系统，覆盖更广的蛋白质组
适用于磷酸化蛋白、乙酰化蛋白等翻译后修饰分析
三、方法优化要点
固定相选择
类型 适用场景 代表产品
酰胺基柱 糖基化蛋白 Atlantis Premier BEH
二醇基柱 磷酸化蛋白 XBridge Amide
纯硅胶柱 多肽/小片段 ZORBAX HILIC
流动相控制
有机相比例需＞50%（乙腈/水体系），水含量波动±2%即显著影响保留时间
添加10-50mM甲酸铵可改善峰形对称性
四、挑战与解决方案
固定相水解
使用MaxPeak HPS表面技术减少硅羟基暴露，延长柱寿命
避免pH＞8条件（硅胶基质耐受上限）
检测兼容性
优先选择CAD或MS检测器（避免RID基线干扰）
质谱接口需优化去溶剂化温度（建议350℃）
注：实际应用中需结合蛋白质分子量（＞10kDa需300Å孔径）和修饰类型选择专用柱
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